一級生物安全柜只可保護工作人員和環境而不保護樣品。其原理和實通分柜類似，但是安全柜的排氣口安裝有安裝過濾器。所生物安全柜在排氣和進氣口都需要使用過濾器。一級生物安全柜本身沒有風機，依靠外接通風管中的風機帶動氣流，但是因為一級生物安全柜保護樣品，如今已鮮少有人使用。

二級B型生物安全柜都是連接排氣系統的安全柜。連接安全柜排氣導管的風機連接緊急供應電源，在斷電下仍可保持安全柜處于負壓狀態，不會市危險氣體泄漏出實驗室。

三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設計的，是目前安全防護等級最高的安全柜。柜體完全氣密，全排放式，一切氣體都不參與循環，工作人員則是通過連接在柜體的手套進行實驗的，即手套箱，樣品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染，適用于高風險的生物試驗。

生物安全柜的工作原理主要是將柜內空氣向外抽吸，使柜內保持負壓狀態，通過垂直氣流來保護工作人員；外界空氣經高效空氣過濾器過濾后進入安全柜內，以避免處理樣品被污染；柜內的空氣也需經過HEPA過濾器過濾后再排放到大氣中，可以有效的保護環境。